Sequenciamento de DNA: o que é e métodos
Atualizado: há 1 dia
O sequenciamento de DNA é uma ferramenta essencial para a pesquisa científica e para diversas aplicações clínicas e tecnológicas em diferentes áreas, como biotecnologia, agricultura e medicina de precisão.
Neste artigo, entenda mais sobre o Sequenciamento de Sanger, o Sequenciamento de Nova Geração, e o Sequenciamento de Terceira Geração. Além disso, conheça algumas aplicações e a importância do sequenciamento de DNA.
O que é sequenciamento de DNA
O sequenciamento de DNA é uma técnica utilizada para identificar a sequência de nucleotídeos (Adenina, Guanina, Citosina e Timina) em uma molécula de DNA.
Conhecer a sequência de nucleotídeos de um trecho de DNA é fundamental para identificar genes, mutações e variações genéticas associadas a características biológicas ou doenças. Através do sequenciamento é possível:
Compreender a organização e a função do material genético;
Auxiliar no diagnóstico de inúmeras doenças genéticas;
Desenvolver tratamentos personalizados;
Identificar microrganismos;
Realizar estudos evolutivos, entre outras aplicações.
Conheça mais a seguir sobre os principais métodos utilizados para realizar o sequenciamento de DNA.
Sequenciamento de Sanger
O Sequenciamento de Sanger foi a primeira metodologia de sequenciamento de DNA, desenvolvida pelo bioquímico britânico Fred Sanger e seus colaboradores na década de 70. Por isso, é considerado também como Sequenciamento de Primeira Geração.
O método Sanger, também chamado de método de terminação da cadeia ou sequenciamento dideoxi, consegue determinar a sequência de DNA de segmentos entre 800 e 1000 pares de base de comprimento.
Figura 1: Principais etapas do sequenciamento de Sanger. (1) Preparação da reação contendo nucleotídeos modificados fluorescentes. (2) Síntese de novas fitas de diferentes tamanhos, pois são interrompidas aleatoriamente pela incorporação dos nucleotídeos modificados. (3) Separação dos fragmentos por eletroforese capilar. (4) Detecção da fluorescência emitida pelos nucleotídeos modificados e reconstrução da sequência de DNA.
Esse foi o método utilizado no Projeto Genoma Humano, realizado entre 1990 e 2003, com o objetivo ambicioso de sequenciar todo o genoma humano. Como esta era a tecnologia disponível na época, ainda não era possível sequenciar trechos muito longos de DNA.
Assim, para alcançar o grande feito do Projeto, foi preciso montar o genoma como um quebra-cabeça. Primeiro, sequenciaram fragmentos menores de DNA. Depois, com o auxílio de ferramentas computacionais, essas sequências foram alinhadas de acordo com as regiões de sobreposição entre elas para compor sequências mais longas.
Atualmente, o sequenciamento do genoma é realizado por métodos mais eficientes em termos de rapidez e custo. Porém, o sequenciamento de Sanger ainda é o método de sequenciamento de DNA mais preciso.
Por isso, o método Sanger continua sendo utilizado, especialmente para sequenciar um único gene, para identificar uma variante genética específica e para confirmar resultados obtidos por Sequenciamento de Nova Geração.
Sequenciamento de Nova Geração
O Sequenciamento de Nova Geração (NGS), também chamado de Sequenciamento de Segunda Geração, é um conjunto de tecnologias de sequenciamento de DNA mais rápidas e baratas do que o Sequenciamento Sanger.
Em geral, são classificadas como tecnologias de Sequenciamento de Segunda Geração aquelas baseadas em leituras curtas (short-read sequencing).
Essas metodologias realizam o sequenciamento massivo em paralelo, ou seja, milhares de pequenos fragmentos de DNA são sequenciados simultaneamente.
Com isso, muitos genes podem ser sequenciados ao mesmo tempo, e amostras de muitos pacientes podem ser analisadas em uma mesma reação. Ao viabilizar análises em alta escala, houve uma redução drástica no custo de sequenciamento de DNA.
Ao final do Projeto Genoma Humano, em 2003, estima-se que o custo para sequenciar um genoma era cerca de 50 milhões de dólares. Com o advento das tecnologias de Sequenciamento de Nova Geração, o custo estimado por genoma caiu para aproximadamente 300 mil dólares no final de 2008. Atualmente, este custo é menor do que 1.000 dólares.
Sequenciamento de Terceira Geração
O Sequenciamento de Terceira Geração engloba tecnologias de sequenciamento de leituras longas (long-read sequencing), capazes de determinar a sequência de fragmentos extensos de DNA em uma única leitura.
Essa abordagem permite a análise de regiões altamente repetitivas do DNA e estruturalmente complexas do genoma, que são de difícil resolução por tecnologias de leituras curtas.
Como resultado, facilita o alinhamento das sequências, melhora a montagem do genoma e aumenta a precisão na identificação de variantes estruturais e de rearranjos genômicos.
O Projeto Genoma Humano, finalizado em 2003, sequenciou cerca de 92% do genoma humano. Os 8% restantes foram determinados em 2022 pelo Consórcio Telomere-to-Telomere, que utilizou a tecnologia de leituras longas para completar o sequenciamento do genoma humano.
Apesar de promover avanços em alguns quesitos, o sequenciamento de leituras longas ainda apresenta limitações para aplicação na prática clínica, incluindo maior custo por base sequenciada, menor precisão por leitura e menor capacidade de processamento de amostras em comparação ao sequenciamento de leituras curtas.
História do sequenciamento de DNA
As análises genômicas vêm sendo desenvolvidas e utilizadas desde a década de 1970. A seguir, veja um resumo das gerações de sequenciamento de DNA:
1975 - Sequenciamento de Primeira Geração: Inclui o sequenciamento de Sanger, que faz o sequenciamento de um fragmento de DNA por vez, com alta precisão, porém baixa escalabilidade e alto custo.
Anos 2000 - Sequenciamento de Nova Geração: Realiza o sequenciamento paralelo de milhões de fragmentos de DNA, aumentando significativamente a velocidade e reduzindo os custos. Tornou viáveis aplicações em larga escala, como sequenciamento de exomas e de genomas completos.
2011 - Sequenciamento de Terceira Geração: Baseada no sequenciamento de moléculas únicas em tempo real, sem necessidade de amplificação por PCR. Produz leituras longas, permitindo resolver regiões repetitivas e variantes estruturais complexas.
O Projeto Genoma Humano
O Projeto Genoma Humano (PGH) foi uma iniciativa ambiciosa com o objetivo de sequenciar o genoma humano. O projeto foi desenvolvido entre 1990 e 2003, envolvendo pesquisadores de universidades e centros de pesquisas de 6 países.
O PGH determinou a sequência de aproximadamente 92% do genoma humano, identificando e mapeando aproximadamente 20.000 a 25.000 genes humanos.
Esse foi o primeiro grande esforço para mapear a informação genética da nossa espécie, que estabeleceu a primeira sequência de referência do genoma humano.
A disponibilidade de um genoma de referência tornou possível identificar variantes genéticas com maior precisão e compreender sua relação entre genótipos e fenótipos.
O PGH impulsionou avanços significativos na genética médica, na genômica e na biotecnologia, estimulando a formação de uma geração de especialistas em biologia molecular e bioinformática e o aprimoramento de novas tecnologias de sequenciamento de DNA e ferramentas de bioinformática.
Telomere-to-telomere
Embora o Projeto Genoma Humano tenha representado um marco para a genômica, sua sequência de referência ainda apresentava lacunas, principalmente em regiões altamente repetitivas do DNA, como telômeros e centrômeros.
Essas regiões são difíceis de reconstruir utilizando tecnologias de sequenciamento de leituras curtas, pois os pequenos fragmentos gerados dificultam o alinhamento correto e a montagem contínua da sequência genômica.
Avanços nas tecnologias de Sequenciamento de Terceira Geração, aliados ao desenvolvimento de novos algoritmos de montagem genômica, permitiram superar essas limitações.
Em 2019, o Consórcio Telomere-to-Telomere (T2T) anunciou progressos importantes na obtenção de sequências genômicas contínuas e, em 2020, publicou o primeiro cromossomo humano completamente sequenciado, de uma extremidade à outra. O nome do consórcio faz referência ao seu objetivo de obter a sequência integral dos cromossomos, desde um telômero até o outro.
Em 2022, o T2T publicou na revista Science a primeira sequência completa do genoma humano, ampliando o conhecimento sobre a organização e a função do DNA.
Para que serve o sequenciamento de DNA
O sequenciamento de DNA permite compreender a organização e a função do material genético, contribuindo para o diagnóstico de doenças genéticas, o desenvolvimento de tratamentos personalizados, a identificação de microrganismos, estudos evolutivos, entre outras aplicações.
Conheça a seguir exemplos de como o sequenciamento de DNA pode ser usado para diferentes finalidades:
Diagnóstico genético: testes genéticos que utilizam o sequenciamento de DNA podem auxiliar na análise de genes e na identificação de mutações associadas a doenças genéticas, incluindo doenças raras.
Medicina de precisão: o sequenciamento permite identificar variantes genéticas que influenciam a resposta a medicamentos e orientar tratamentos personalizados para cada paciente.
Identificação de microrganismos: a análise do DNA possibilita detectar e caracterizar bactérias, vírus, fungos e outros patógenos, contribuindo para o diagnóstico de infecções e a vigilância epidemiológica.
Pesquisa em genômica e evolução: a comparação de sequências de DNA permite investigar a função de genes, compreender a evolução das espécies e identificar relações de parentesco entre organismos.
Melhoramento genético: o sequenciamento de DNA auxilia na identificação de genes de interesse em plantas e animais, acelerando programas de melhoramento voltados para maior produtividade, resistência a doenças e adaptação ambiental.
Sequenciamento de DNA na OLLIN Análises Genômicas
Com grande experiência em sequenciamento de DNA, a OLLIN Análises Genômicas utiliza o Sequenciamento de Nova Geração para realizar análises de alta qualidade e auxiliar no diagnóstico de doenças genéticas.
Referências
Eren K, Taktakoğlu N, Pirim I. DNA Sequencing Methods: From Past to Present. Eurasian J Med. 2022;54(Suppl1):47-56. doi:10.5152/eurasianjmed.2022.22280
Human Genome Project Fact Sheet. National Human Genome Research Institute.
Massively parallel sequencing. National Genomics Education Programme - NHS.
Next-generation sequencing. National Genomics Education Programme - NHS.
Sanger Sequencing. National Genomics Education Programme - NHS.
Wetterstrand KA. DNA Sequencing Costs: Data from the NHGRI Genome Sequencing Program (GSP).
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